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动物微生物学实验指导.pdf

目 录

实验 1 细菌的简单染色和革兰氏染色

实验 2 细菌的芽胞荚膜鞭毛染色及运动性观察

实验 3 微生物细胞形态及菌落特征观察

实验 4 培养基制作、灭菌消毒及无菌操作接种技术

实验 5 微生物的分离纯化与稀释平板菌落计数

实验 6 微生物细胞大小测定及显微镜直接计数

附录 1 常用培养基配方

附录 2 常用染色液的配制

附录 3 常用试剂和指示剂的配制参考书目

 

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    实验 1 细菌的简单染色和革兰氏染色

    一、实验目的

    1、 学习细菌的简单染色法和革兰氏染色法;

    2、 学习显微镜油镜观察的方法;

    二、实验内容

    1、 细菌的简单染色;

    2、 细菌的革兰氏染色;

    三、实验原理

    简单染色法是一种最基本的染色方法,是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。因细菌蛋白质等电点较低,当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,而碱性染料的离子带正电荷,能和带负电荷的物质结合。所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红)等进行染色,当这类染料解离后,染料离子带正电荷,使菌体着色。简单染色一般难于辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的重要鉴别染色反应。通过革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+ )和革兰氏阴性菌(G-)两大类。这是因为两类菌的细胞壁结构和成分的不同,G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经过蕃红复染后就成红色。G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色,即紫色。

    四、实验材料

    1、活材料:培养 12~16h 的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus),培养 24h 的大肠杆菌(Escherichia coli)。

    2、染色液和试剂:结晶紫、卢哥氏碘液、95%酒精、蕃红、复红、二甲苯、香柏油。五、实验用品废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、滴管、玻片搁架、镊子、无菌水、75%乙醇浸泡的消毒棉球、盛有 75%乙醇的玻片回收缸、生物显微镜等。

    六、实验方法

    (一)简单染色

    1、涂片:用消毒棉球擦拭双手,用镊子取干净载玻片一块,在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水,按无菌操作法取菌涂片,左边涂苏云金芽胞杆菌,右边涂大肠杆菌,做成浓菌悬液。再取干净载玻片一块,挑刚制成的苏云金芽胞杆菌浓菌悬液 2~3 环涂在左边制成薄的涂面,将大肠杆菌的浓菌液取 2~3 环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面,注意取菌不要太多。

    2、晾干:让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。★是否还有其它方法?

    3、固定:手执玻片一端,让菌膜朝上,通过火焰 2~3 次固定,以不烫手为宜。★为什么要进行该步骤?

    4、染色:用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上,加复红染色 1~2min。

    5、水洗:水洗去涂片上的染色液。

    6、干燥:将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干,勿将菌体擦掉。

    7、镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油一滴,将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。★怎样操作才能做到既快而又不易损坏玻片地调准焦距?

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